Biosyntéza
Naším hlavním zaměřením je, jak mikroorganismy, zejména bakterie aktinomycety, produkují specializované metabolity. Tyto molekuly jsou složité a dokonce i organickí chemici by měli problém je syntetizovat v laboratoři. To, co odlišuje mikroorganismy, jsou jejich jedinečné enzymy. Tyto enzymy mají pozoruhodnou schopnost přijímat zdánlivě nezajímavé molekuly a transformovat je krok za krokem na sloučeniny, které jsou speciální, složité a biologicky aktivní. Studujeme tyto enzymy a jak fungují a biosyntetizují specializované metabolity. Tyto studie slouží jako nezbytný předpoklad pro naše úsilí vyvinout účinnější antibiotika modifikací biosyntézy nebo prováděním dolování dat na úrovni genomu. Některé enzymy si navíc zaslouží individuální studium kvůli jejich neočekávaným funkcím, využití neobvyklých kofaktorů nebo nových proteinových struktur. Tyto atributy často odhalují nové jevy v přírodě.
Biosyntéza linkosamidů
Linkosamidová antibiotika brání syntéze proteinů v bakteriálních buňkách vazbou na ribozomální podjednotku 50S. Linkosamidy jsou přirozeně produkovány aktinomycetami, které tvoří malou skupinu přírodních produktů s jednoduchými strukturami, složenými primárně z jedné aminokyseliny a aminothiocukru. Sestavení linkomycinu, reprezentativního linkosamidu, však vyžaduje více než 20 biosyntetických enzymů a zahrnuje pozoruhodně složité a zajímavé mechanismy. Genetické inženýrství pro přípravu knock-out kmenů, heterologní produkce a purifikace enzymů, enzymatické testy, kapalinová chromatografie s hmotnostní spektroskopií a krystalografie jsou nejvýznamnější techniky, které používáme k odhalení biosyntetických strojů bioaktivních metabolitů.
Příprava účinnějších antibiotik
Detailní pochopení toho, jak aktinomycety biosyntetizují bioaktivní molekuly, představuje cennou příležitost k vývoji vylepšených léků. Sekvence biosyntetických kroků, enzymová promiskuita, reakční specificita a katalytické mechanismy slouží jako plán pro nasměrování biosyntézy směrem k syntéze strukturních analogů, které mohou vykazovat vyšší účinnost nebo jiné zlepšené vlastnosti.
Těžba genomu k objevení nových bioaktivních metabolitů
Významná část současných antibiotik pochází z aktinomycet. Tyto mikroorganismy, původně izolované z půdy nebo jiného prostředí, byly kultivovány v laboratorních podmínkách a antibiotika, která produkovala, byla objevena pomocí dobře zavedených metod řízených biologickými testy, především během 50. až 70. let 20. století. Intenzita screeningů, zejména půdních aktinomycet, však vedla k vysoké míře znovuobjevení, takže tato strategie byla časem neúčinná.
Zatímco objevování nových bioaktivních metabolitů izolací aktinomycet z přírodních zdrojů představuje výzvu, existuje alternativní přístup. Slibné řešení nabízí využití exponenciálně rostoucího objemu sekvenačních dat ve veřejných databázích, které obsahují informace o biosyntetických genech bioaktivních metabolitů.
Často se nás ptáte
Objev odlišných reakčních specificit enzymů závislých na pyridoxal-5-fosfátu při biosyntéze linkomycinu a linkosamidů celesticetinu nás inspiroval k použití technik genetického inženýrství, jako je REDIRECT PCR-targeting a metoda CRISPR-Cas9 ke kombinaci těchto dvou cest. Stručně, převedli jsme linkosamidový meziprodukt purifikovaný z knock-out kmene produkujícího linkomycin pěti heterologně produkovanými enzymy z biosyntézy celesticetinu. Tímto způsobem jsme připravili převratnou linkosamidovou chiméru CELIN, která vykazovala lepší antibiotickou účinnost ve srovnání s jinými linkosamidy. Nyní provádíme preklinické studie, abychom zjistili potenciál CELINu pro uplatnění v klinické praxi. V současné době spolupracujeme se společností Santiago Lab, přední společností zabývající se organickou syntézou, abychom zvýšili efektivitu CELINu prostřednictvím cílených úprav. Naším konečným cílem je vyvinout linkosamidy schopné vázat se na (di)methylované ribozomy, a tím řešit kritický problém antibiotické rezistence, zejména proti MRSA (methicilin-rezistentní Staphylococcus aureus ). MRSA představuje jeden z nejnáročnějších patogenů, pro který jsou naléhavě potřeba nová antibiotická řešení.
Příslušné papíry:
Příslušný mezinárodní patent:
Deriváty linkosamidu, jejich příprava a použití jako antimikrobiální činidlo
Janata, Jiří; Kameník, Zdeněk; (…); Gazák, Radek
3. listopadu 2020 | Oficiální věstník patentů patentového úřadu Spojených států amerických
Ruční prohledávání rozsáhlého objemu sekvenačních dat je dnes téměř nemožné. Motivováni absencí vhodného bioinformatického nástroje pro automatizaci tohoto procesu jsme jeden vyvinuli. Tento nástroj s názvem CluSeek nejen identifikuje zajímavé genové shluky v databázi GenBank, ale nabízí také komplexní analýzu. CluSeek je vysoce univerzální, schopný analyzovat jakýkoli typ genového shluku bez ohledu na kódovaný fenotyp. Je uživatelsky přívětivý a lze jej snadno spustit a používat i těmi, kdo nemají IT znalosti. CluSeek je veřejně přístupný, tak to vyzkoušejte: http://www.cluseek.com
Zaujaly nás metabolity se vzácným motivem 4-alkyl-L-prolinu kvůli jejich zvýšené biologické aktivitě ve srovnání s analogy obsahujícími běžný L-prolin. To platí nejen pro antibiotikum linkomycin (vazba) na ribozomy, ale také pro protirakovinné pyrrolobenzodiazepiny (vazba na DNA), z nichž některé sdílejí tento motiv také. Přemýšleli jsme, zda existuje více metabolitů nesoucích tento cenný motiv, využili jsme naše znalosti o tom, jak jej aktinomycety syntetizují. Konkrétně jsme předložili geny zapojené do biosyntézy 4-alkyl-L-prolinu CluSeek a identifikovali jsme více než 200 nových genových shluků v rámci GenBank. Ty odpovídají více než 13 strukturně odlišným třídám (srovnejte tři dosud známé), které pravděpodobně obsahují motiv 4-alkyl-L-prolinu.
Díky rozsáhlé globální spolupráci máme nyní mnoho z těchto kmenů v rukou. Naše současné úsilí zahrnuje tradiční kultivaci aktinomycet, heterologní expresi biosyntetických genových klastrů, studie značení stabilních izotopů a metabolomiku hmotnostní spektrometrie k určení skutečných metabolitů. Následně budou tyto metabolity purifikovány pomocí preparativní vysokoúčinné kapalinové chromatografie.